在生命科學(xué)領(lǐng)域，隨著科研水平和實驗手段不斷的提高，熒光染色方法以其特異性強(qiáng)，使用相對于放射性元素更安全，檢測越來越靈敏等特點，受到越來越多的研究人員的認(rèn)可，并且在實驗室中廣泛應(yīng)用，成為經(jīng)常性的實驗方法。
檢測熒光方法和手段根據(jù)不同的實驗要求和目的也多種多樣，使用最多的還是熒光顯微鏡，熒光酶標(biāo)儀，流式細(xì)胞儀等。但是，無論何種儀器，無論儀器的性能如何，要得到準(zhǔn)確的實驗結(jié)果，準(zhǔn)確的實驗數(shù)據(jù)，最基本的條件就是根據(jù)所使用的熒光染料正確設(shè)置激發(fā)和發(fā)射波長。
奧林巴斯顯微鏡熒光激發(fā)塊
下面我們以熒光顯微鏡的熒光濾色鏡為例，介紹一下濾色鏡組的構(gòu)造以及根據(jù)染料，如何正確選擇濾色片。
熒光激發(fā)塊是熒光顯微鏡中用來激發(fā)熒光標(biāo)本和觀察熒光的核心部件，它實際是濾色片的組合，一般含有3種濾色片:
1. 激發(fā)濾色片（Exciter Filter）：選擇透過某個波段的光，來激發(fā)熒光染料。
2. 分色鏡 （Dichroic Mirror）：反射激發(fā)光，透過熒光，一般激發(fā)光波長短，而發(fā)射光波長較長。
3. 發(fā)射濾色片(Barrier Filter) ：透過發(fā)射光，也就是我們看到的“熒光"。同時阻擋各種雜散光和激發(fā)光的反射光。
奧林巴斯顯微鏡熒光激發(fā)塊
根據(jù)熒光觀察的原理—熒光染料吸收特定波長的光（即激發(fā)光），躍遷到激發(fā)態(tài)，然后再釋放出特定波長的發(fā)射光（即熒光），回到基態(tài)。由此可知熒光染料所需的激發(fā)光和釋放的熒光都是特定波長的，所以需要利用各種濾色片來選擇性的透過某種特定波長的光來實現(xiàn)熒光觀察。否則，就會出現(xiàn)激發(fā)不了，激發(fā)了卻看不到或串色的現(xiàn)象。所以選擇合適的濾色片非常重要！
下面我們以熒光染料DAPI為例，闡述該如何選擇熒光激發(fā)塊。
通過上圖，我們可以了解到DAPI的激發(fā)光波長為300nm-410nm左右，激發(fā)峰值在360nm左右，也就是說激發(fā)光在300-410nm時可以激發(fā)DAPI染料，在360nm時激發(fā)高。發(fā)射光波長為390nm-600nm，峰值在470nm左右。接著，我們就根據(jù)這些數(shù)據(jù)來選擇濾色片。
上圖為Olympus U-FUW激發(fā)塊的光譜信息。我們可以了解到此激發(fā)塊可以提供的激發(fā)光波長在300-400nm之間，剛好可以激發(fā)DAPI。允許透過的熒光光譜范圍也在410nm以上，所以此激發(fā)塊可以用來實現(xiàn)DAPI熒光染料的觀察。
讓我們再來看一個激發(fā)塊的光譜圖：
上圖為olympus U-FGW激發(fā)塊的光譜信息，可以看出此激發(fā)塊可以提供的激發(fā)光在530-560nm左右，允許透過的熒光光譜范圍在570nm以上，所以此激發(fā)塊并不適合DAPI激發(fā)。如果用此激發(fā)塊來做DAPI的觀察，就會出現(xiàn)看不到熒光的現(xiàn)象。
可見，要選擇合適的熒光激發(fā)塊，我們首先要知道熒光染料激發(fā)和發(fā)射光的波長特性和激發(fā)塊光譜的各項數(shù)據(jù)。但是，熒光染料和濾色片的種類非常多，用戶往往沒有渠道來獲取這些信息。在實際實驗中使用熒光顯微鏡時，因為熒光激發(fā)塊配置錯誤而得不到好的觀察效果的現(xiàn)象經(jīng)常發(fā)生，對于用戶來說是一件非常煩惱的事。
為了方便用戶正確選擇激發(fā)和發(fā)射波長，節(jié)省時間，日本理化研究所腦科學(xué)所－奧林巴斯合作中心開發(fā)了軟件Spectrum Manager。用戶選擇熒光染料，軟件會給出染料的光譜信息和推薦的濾色片選擇等信息，使用非常方便。
還可利用Data Manager自行對光源信息、染料數(shù)據(jù)庫或濾色片信息進(jìn)行更新。
奧林巴斯顯微鏡熒光激發(fā)塊
此款軟件已經(jīng)整合至奧林巴斯共聚焦顯微鏡的一款軟件中，發(fā)布以來得到了用戶非常好的反響。由于是針對共聚焦顯微鏡的軟件，所以軟件中僅提供了激光光源譜線。如果您有需要，也可以將汞燈和氙燈光源信息導(dǎo)入至軟件。
以下提供普通熒光顯微鏡常用的汞燈和氙燈光源的圖譜，供大家參考。
汞燈在313, 334, 365, 406, 435, 546, 578nm有比較好的激發(fā)峰。
氙燈在可見光光譜范圍內(nèi)強(qiáng)度更穩(wěn)定（沒有像汞燈那樣的光譜峰值），在紅外波段比汞燈強(qiáng)度高。但在紫外波段有一定的缺陷性。
所以選擇光源時，光源特性一定要與我們的具體應(yīng)用相匹配。
奧林巴斯顯微鏡熒光激發(fā)塊規(guī)格
| 名稱 | 激發(fā)光波長（顏色） | 發(fā)射光波長（顏色） | 二次分光波長（顏色） | 帶寬 | 通道類型 |
| U-MWU2 | 330-385不可見 | 420藍(lán)色 | 400紫色 | 寬 | 一 |
| U-MNU2 | 360-370不可見 | 420藍(lán)色 | 400紫色 | 窄 |
| U-MNV2 | 400-410紫藍(lán)色 | 455藍(lán)色 | 455藍(lán)色 | 窄 |
| U-MWBV2 | 400-440藍(lán)紫色 | 475藍(lán)色 | 455藍(lán)色 | 寬 |
| U-MNBV2 | 420-440藍(lán)色 | 475藍(lán)色 | 455藍(lán)色 | 窄 |
| U-MWB2 | 460-490藍(lán)色 | 520IF綠色 | 500綠色 | 寬 |
| U-MNB2 | 470-490藍(lán)色 | 520IF綠色 | 500綠色 | 窄 |
| U-MSWB2 | 420-440藍(lán)色 | 475藍(lán)色 | 455藍(lán)色 | 超寬 |
| U-MWIB2 | 460-490藍(lán)綠色 | 510IF綠色 | 505綠色 | 寬 |
| U-MWG2 | 510-550綠色 | 590綠色 | 570綠色 | 寬 |
| U-MNG2 | 530-550綠色 | 590綠色 | 570綠色 | 窄 |
| U-MSWG2 | 480-550綠色 | 590綠色 | 570綠色 | 超寬 |
| U-MWIG2 | 520-550綠色 | 580IF綠色 | 565綠色 | 寬 |
| U-MWIY2 | 545-580綠色 | 610IF紅色 | 600紅色 | 寬 |
| U-MNUA2 | 360-370不可見 | 420-460藍(lán)色 | 400紫色 | 窄 |
| U-MWIBA2 | 460-490藍(lán)色 | 510-550綠色 | 505綠色 | 寬 |
| U-MNIBA2 | 470-490藍(lán)色 | 510-550綠色 | 505綠色 | 窄 |
| U-MGFPHQ | 460-480HQ藍(lán)色 | 495-540HQ綠色 | 485藍(lán)色 | | 雙 |
| U-MYFPHQ | 490-500HQ藍(lán)綠色 | 515-560HQ綠色 | 505綠色 | |
| U-MCFPHQ | 425-445HQ藍(lán)色 | 460-510HQ藍(lán)綠色 | 450藍(lán)色 |
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QQ:2568841715
